CN106619515A - 脂质体组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

提供了包含由全细胞膜组分组成的脂质体的组合物。该脂质体可以附连到药剂上或包封药剂。还提供了制取和使用这些脂质体的方法。

Description

脂质体组合物及其用途
本申请是国际申请日为2010年8月26日、国际申请号为PCT/IL2010/000703、进入国家阶段的申请号为201080048954.X、发明名称为“脂质体组合物及其用途”的PCT申请的分案申请。
相关申请
本申请根据35USC 119(e)要求美国临时专利申请No.61/237,306的优先权权益，该临时专利申请提交于2009年8月27日，其完整内容通过引用合并在此。
技术领域
本发明在其一些实施方式中涉及脂质体组合物及其用途。
背景技术
基于脂质体的DNA和药物递送系统在过去四十年有着广泛的研究，并用作治疗各种病况的装置(mean)。脂质体系统允许在良好界定的生物相容性和非免疫原性脂质囊泡中高效地包埋亲水性和水性化合物，该脂质囊泡的直径为几纳米至几微米。脂质体也可以利用特异性配体如蛋白质结合物或结合特异细胞受体的抗体靶向。在癌症治疗中，脂质体系统是最受欢迎且全面研究的药物载体之一。这主要由于增强渗透性和滞留(EPR)效应，所述增强渗透性和滞留效应是指肿瘤血管的血管渗透性由于肿瘤血管新生而增大。EPR效应导致脂质体累积在肿瘤细胞外液中，这作为被动靶向机制而被利用。用于癌症治疗的脂质体药物递送的现有技术状态主要包括批准用于临床使用的药物(例如，DaunoXomeTM、MyocetTM、DoxilTM、CaelyxTM)。当前调查了使脂质体系统靶向癌症的数种途径，包括使靶向部分(targeting moiety)与脂质体表面(例如，抗体)结合。合成的阳离子脂质体是最常用的DNA递送载体，但不论是体外还是体内优选的DNA转移途径，它们的细胞毒性仍然是个问题。另一方面，更加类似于细胞来源的脂质体(就它们的电荷而言)的阴离子脂质体也被证明可以介导基因转移，但包封率较差，这由未凝集DNA(uncondensed DNA)的大尺寸和负电荷引起。通过使DNA与阳离子或聚阳离子(poly-cations)络合(complexation)可以提高包封率和保护DNA不受降解，这种络合随后也显著提高转染效率。
近十年来，数个研究已揭示当向荷瘤动物给予某些原代细胞，如成人间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)、成人造血干细胞(HSC)和内皮细胞时，它们累积在肿瘤微环境中。最新数据表明分离的肿瘤细胞膜组分似乎包含强有力的MSC引诱剂(attractant)，多于从相同细胞分离的细胞质组分中所包含的。这个数据暗示，MSC靶向肿瘤细胞的机制主要由在肿瘤和MSC上发现的表面分子结合产生的细胞与细胞之间的相互作用控制。然而，细胞对新生血管和肿瘤细胞分泌的不同可溶性因子(例如，趋化因子)的反应被认为也被暗示在某种程度上参与MSC归巢(homing)机制。该归巢机制激发人们研究这些细胞作为癌症治疗的靶向递送媒介物(vehicle)的应用。在这些研究中，原代细胞被分离并用感兴趣的不同基因，抗癌基因或报告基因转导。将该细胞移植到荷瘤动物中，并利用表达的报告蛋白确定它们对肿瘤微环境的归巢。肿瘤抑制利用表达的抗癌症蛋白质实现。
源自哺乳动物细胞的细胞质膜的脂质体通常用作研究膜和细胞机制的工具。也对细胞来源的脂质体(CDL或复数的CDL)作为癌症免疫治疗的工具进行了研究。在这些研究中，脂质体由肿瘤细胞膜制备，并用作激发针对位于脂质体膜上的肿瘤抗原的免疫系统的佐剂。然而，细胞来源的脂质体从未从干细胞生产出，也从未用作递送媒介物。此外，也从未开发出用作靶向平台的CDL系统。
相关技术：
Boone，C.W.，Ford，L.E.，Bond，H.E.，Stuart，D.C.&Lorenz，D.Isolation ofplasma membrane fragments from HeLa cells.J Cell Biol 41，378-392(1969).
Westerman and Jensen Methods Enzymol.2003；373：118-27.
发明内容
根据本发明一些实施方式的方面，提供了包含附连(连接，attach)到药剂上或包封(encapsulate)药剂(pharmaceutical gent)的脂质体的物质组合物(组合物，composition-of-matter)，该脂质体由全细胞膜组分(whole cell membrane fraction)组成。
根据本发明一些实施方式，该细胞是人细胞。
根据本发明一些实施方式，全细胞膜的细胞来源选自干细胞、原代细胞(primarycell)、细胞系(cell-line)、非致瘤细胞(non-tumorigenic cell)、癌细胞和免疫细胞组成的组。
根据本发明一些实施方式的方面，提供了包含由干细胞的全细胞膜组分组成的脂质体的物质组合物。
根据本发明一些实施方式，该干细胞包含人间充质干细胞。
根据本发明一些实施方式的方面，提供了包含由原代人细胞的全细胞膜组分组成的脂质体的物质组合物。
根据本发明一些实施方式的方面，提供了包含由非致瘤人细胞的全细胞膜组分组成的脂质体的物质组合物。
根据本发明一些实施方式，该细胞膜经受基因修饰从而表达外源蛋白(exogenousprotein)。
根据本发明一些实施方式，该外源蛋白选自细胞标记(细胞标记物，cellmarker)、靶向部分(targeting moiety)和药剂组成的组。
根据本发明一些实施方式，该脂质体包封药剂，或者附连到药剂上。
根据本发明一些实施方式，该药剂是治疗剂(治疗剂，therapeutic agent)。
根据本发明一些实施方式，物质组合物在人对象(主体、受验者，subject)中是非免疫原性的。
根据本发明一些实施方式，该全细胞膜组分的细胞来源包含宿主对象的自体(autologous)细胞。
根据本发明一些实施方式，该全细胞膜组分的细胞来源包含宿主对象的非自体(non-autologous)细胞。
根据本发明一些实施方式，所述脂质体在其外表面上附连到合成的聚合物上。
根据本发明一些实施方式，该药剂是诊断剂。
根据本发明一些实施方式，该脂质体是单层脂质体(单层的、单室的，unilamellar)。
根据本发明一些实施方式，该脂质体在其外表面上附连到合成的聚合物上。
根据本发明一些实施方式，合成的聚合物是聚乙二醇(PEG)。
根据本发明一些实施方式，该脂质体的尺寸在30-1000nm的范围内。
根据本发明一些实施方式的方面，提供了生产脂质体的方法，包含：
(a)使细胞经受低渗条件(hypotonic conditions)，以便获得破裂的细胞膜和/或空胞(ghost)；和
(b)使破裂的细胞膜和/或空胞均质化(homogenize)从而产生脂质体。
根据本发明一些实施方式，该均质化通过以下而实现：
(c)超声处理破裂的细胞膜和/或空胞，和可选地
(d)通过具有预定孔隙(孔隙度，porosity)的基质(matrix)挤出破裂的细胞膜和/或空胞。
根据本发明一些实施方式，该方法进一步包含在步骤(c)之后使合成的聚合物结合到脂质体上。
根据本发明一些实施方式的方面，提供了将药剂包封在脂质体中的方法，该方法包含根据上面的方法制造脂质体和在均质化步骤之前加入药剂。
根据本发明一些实施方式的方面，提供了包含作为活性成分的物质组合物，和药物可接受载体的药物组合物。
根据本发明一些实施方式的方面，提供了递送药剂的方法，该方法包含向需要其的对象给予物质组合物，从而递送药剂。
根据本发明一些实施方式，该全细胞膜组分的细胞来源对于对象是自体的。
根据本发明一些实施方式，该全细胞膜组分的细胞来源对于所述对象是非自体的。
除非另有限定，否则本文使用的所有技术和/或科学术语的含义都与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同。虽然下面描述了示例方法和/或材料，但本发明实施方式的实施或试验中可使用与本文所描述的那些相似或者等效的方法和材料。如有冲突，以专利说明书为准，包括定义。另外，材料、方法和实施例仅为了说明，而未必是限制。
附图说明
本文仅参考随附的图像和图片[图像1-10，图片11]举例说明本发明的一些实施方式。关于下面详细讨论的图像/图片，要强调的是，所示细节仅为了举例，用于示意性地讨论本发明的实施方式。在这方面，参考图像/图片所作的描述将使本领域普通技术人员明了本发明的实施方式如何实施。
在图中：
图1A-1C描绘了人MSC。通过吉姆萨(Giemsa)染色显现细胞形态(图1A、1B)并通过流式细胞术分析典型的MSC(阳性和阴性)表面标记(图1C)。
图2是示出hMSC朝癌细胞迁移的照片。逐滴接种DiI(红色)标记的hMSC和DiO(绿色)标记的BHK、PC3、Cf2Th和COS-7细胞。温育72小时后的Maestro显像证明hMSC朝PC3前列腺细胞特异性迁移，同时“避开”其它细胞系。
图3是示出MCF 7来源的调整培养基(条件培养基，condition media)刺激hMSC靶向MCF7乳腺癌细胞系的图片。
图4A-4B是细胞来源的脂质体的低温(Cryo)TEM图像。细胞来源的脂质体由hMSC细胞质膜制备，并通过与单甲氧基-PEG结合而PEG化(聚乙二醇化，PEGylated)。然后通过低温TEM使形成的PEG化(图4A)和未PEG化CDL(图4B)显像。
图5A-5C是示出CDL的DLS和Z(Zeta)-电位(Z电势)分析的图片。通过数量重量(数均重量，Number-weight)DLS(图5A)、体积重量(体积均重量，Volume-Weight)DLS(图5B)和Z-电位(图5C)分析未PEG化和PEG化的hMSC来源的CDL的尺寸、尺寸分布和电荷。
图6示出hMSC来源的脂质体的表面标记特征。由hMSC制备CDL，使其与甲苯磺酰基活化的DynabeadsTM结合，并针对hMSC特异性膜标记(即，CD44、CD29、CD90和CD105)进行FACS分析。
图7A-7B示出由hMSC制备的CDL与前列腺癌细胞系(PC3)的结合。将PC3细胞用DiO(绿色)标记，并与之前用DiI(红色)标记的CDL一起温育。温育12小时后使培养物显像。示出代表性3D-投影图像(图7A)和单层(单片，single slice)图像(图7B)。
图8A-8B是示出由hMSC制备的CDL与前列腺癌细胞系(PC3)的浓度依赖性结合的图片和FACS直方图(histogram)。将PC3细胞与之前用红色荧光染料(DiI)标记的各种浓度的CDL一起温育。温育24小时后，洗涤、收获细胞并通过FACS分析(图8A)。计算该细胞的平均荧光强度，对该平均荧光强度与CDL浓度的自然对数作图(图8B)。
图9示出由调整hMSC(即，用癌细胞调整培养基培养的细胞)制备的CDL与前列腺癌细胞系(PC3)的特异性结合。由之前已与源自前列腺癌细胞系(PC3)和非人细胞系(BHK)的调整培养基一起温育24小时的hMSC制备DiI-标记的CDL。将由此形成的“调整”CDL，以及由未调整hMSC(对照，无CM)制备的CDL，与PC3和BHK细胞一起温育15min、1小时和3小时。温育后，洗涤、收获细胞并通过FACS分析。标记中的百分比是指标记中DiI标记的细胞比率。仅在左上角直方图中指出的括号内的百分比是指标记中未标记细胞的比率。标记和标记中未标记细胞百分比对于所有直方图都是相同的。
图10A-10B是包埋可溶性肿瘤坏死因子相关性细胞凋亡诱导配体(sTRAIL)的，hMSC来源的脂质体的低温TEM图像。所制备的含sTRAIL的CDL(图10A)和空CDL(图10B)的终浓度相同，并在相同条件下通过低温TEM显像。为了突出CDL含量，将初始灰度的低温TEM图像(左侧)重新着色成黑色和白色(右侧)。
图11示意性示出基于细胞来源的脂质体(CDL)的靶向载体的整体设计。选择天然特异性地与靶细胞相互作用的源细胞(原始细胞，origin cell)作为细胞来源的脂质体来源。例如，因此选择通过膜与癌细胞相互作用的MSC作为癌症靶向载体来源。对来源细胞(source cell)进行低渗处理从而得到空胞细胞(ghost cell)，然后使空胞细胞均质化从而制得CDL。由此产生的CDL然后可以与它的来源细胞类似的方式特异性地结合其靶细胞。
具体实施方式
本发明在其一些实施方式中涉及脂质体组合物及其用途。
在详细解释本发明的至少一个实施方式之前，应理解本发明的应用不必局限于下面说明中陈述的或通过实施例举例说明的细节。本发明能够有其它实施方式，或能够以多种方式实施或实现。
癌症治疗面临的主要挑战是对癌细胞产生细胞毒作用，同时不伤害健康细胞。开发用于癌症治疗的新型靶向治疗递送策略的重要性早已被世界公以。
本发明人已设计出用于将治疗和诊断剂靶向递送到细胞和组织中的新型递送媒介物。该递送媒介物基于脂质体，由包含天然脂质和蛋白质的全细胞膜组分组成。通过采用自然(天然，native)细胞膜，可以将本发明递送媒介物调配成具有低潜在免疫原性，容易归巢到靶组织中，且可以进行基因修饰从而表达治疗剂或靶向部分。
如下面和后面实施例部分说明的，本发明人已制得由
间充质干细胞的全细胞膜组成的脂质体，间充质干细胞因它们的归巢能力以及它们的免疫抑制能力(即，它们减轻炎症和抑制免疫细胞的能力)和低免疫原性特征(即，似隐形特征(stealth-like feature)，这种特征使得在进行异源移植时它们作为外来物质免疫原性较小且不太容易被识别)而闻名。该脂质体表现出间充质干细胞的蛋白质签章(proteinsignature)，因此预期可以介导与完整间充质干细胞类似的免疫抑制和迁移特性。使这些细胞来源的脂质体进一步PEG化从而增大它们的生物利用率和分散性，并降低它们的凝聚性。还对该细胞来源的脂质体进行处理从而使其包封治疗剂。总之，从这些研究结果可以看出，本发明递送系统可以作为诊断和治疗人疾病如癌症的重要工具。
因此，根据本发明的方面，提供了包含附连到药剂上或包封药剂的脂质体的物质组合物，所述脂质体由全细胞膜组分组成。
如本文使用的术语“脂质体”是指全封闭的载体分子(fully closed carriermolecules)，其包含本身为液晶相或液体凝胶相的球形脂质膜，其中包含所包埋液体的体积。该两种液相是不混溶的。因而，本发明脂质体(在本文也称为细胞来源的脂质体(CDL)，类似于细胞的膜，是完全凝胶/液体状态和/或液晶状态而不是固体状态。
本发明一些实施方式的脂质体具有预期的蛋白质脂质比，约为0.8w/w。
应注意，hMSCc CDL的蛋白质含量约为0.8mg/108个细胞(如通过Bradford分析测得的)。该脂质含量容易利用Stewart磷脂分析测定。预期它为约1mg/108个细胞。
可以利用下面的计算确定理论磷脂含量。因为单个哺乳动物细胞的干质量(干重)为10-7mg1数量级，且因为磷脂大约构成该干细胞质量2的10％，因此该细胞来源的脂质体生产过程(假定100％效率)的理论产量应为10-8mg磷脂/单个细胞或1mg/108个细胞的数量级。
脂质体包括泡囊(niosome)、转铁体(transfersome)、乳剂、泡沫、胶束(micelle)、液晶、分散体、层状层(片状层，lamellar layer)等。
该脂质体可以是单层脂质体或多层脂质体(多层的，multilamellar)。
根据本发明具体实施方式，该脂质体是单层脂质体，如通过低温TEM测定的。
根据本发明具体实施方式，该脂质体具有自然膜对称性和自然标记的表达。
本发明脂质体由全细胞膜组分组成。
如本文使用的短语“细胞膜”或“细胞的膜”(它们可以互换使用)是指生物膜，该生物膜包围细胞或者是其细胞器(例如，叶绿体、ER、高尔基质、线粒体、液泡、细胞核和溶 酶体)不可缺少的部分。
根据本发明具体实施方式，细胞膜是指质膜。使用质膜具有特别的优势，因为它呈递和细胞与细胞之间的相互作用关联的蛋白质，以及其它识别分子，如结合可溶性配体的受体。
如本文使用的“全细胞膜组分”是指不仅包括脂质而且包括膜蛋白质的组分。
膜蛋白质实例包括，但不局限于，整合蛋白(integral protein)、跨膜蛋白、脂质锚定蛋白(lipid anchored protein)和糖蛋白。
根据本发明实施方式，全细胞膜组分也包括碳水化合物。
根据具体实施方式，该细胞是真核细胞[例如，哺乳动物(如人)、植物、昆虫细胞]。
根据另外的具体实施方式，该真核细胞是哺乳动物细胞。
根据又一个另外的实施方式，该细胞可以是原代细胞(即，非永生化(non-immortalized)且有时未被培养)或细胞系。
根据又一个另外的实施方式，该细胞可以是胚细胞。
对于在自体或非自体(同系异体(同种异体，syngeneic allogeneic)或异种(xenogeneic))环境中使用未培养细胞的临床应用，使用原代细胞是有利的。
根据具体实施方式，该真核细胞是干细胞。
如本文使用的短语“干细胞”是指，在培养时能够长时间保持未分化状态(例如，多能性(全能，pluripotent)干细胞或多能(multipotent)干细胞)，直到被诱导分化成具有特定专一化功能的其它细胞类型(例如，完全分化的细胞)的细胞。优选地，短语“干细胞”包括胚胎干细胞(ESC)、诱导的多能干细胞(iPS)、成人干细胞、间充质干细胞和造血干细胞。
根据具体实施方式，该干细胞是间充质干细胞。
间充质干细胞是形成多能母细胞(formative pluripotent blast cells)。间充质干细胞(MSC)可以产生一种或多种间充质组织(例如，脂肪、骨、软骨、弹性和纤维结缔组织、成肌细胞、心肌样细胞)以及除起源于胚胎中胚层(例如，神经细胞)的组织之外的组织，这取决于来自生物活性因子如细胞因子的各种影响。MSC可以从胚胎卵黄囊(embryonicyolk sac)、胎盘(placenta)、脐带、胎儿和青少年皮肤、血液、骨髓、脂肪和其它组织中分离出，但它们在骨髓中的丰富度远远超过它们在其它组织中的丰富度。MSC已被证明在包括自身免疫性疾病和移植在内的多种环境下具有免疫抑制功能，使得从其产生的脂质体成为炎症和自身免疫性环境中的终极工具。
分离、纯化和扩增间充质干细胞(MSC)的方法在本领域中是已知的，包括例如Caplan和Haynesworth的美国专利No.5,486,359，以及Jones E.A.等人，2002，Isolationand characterization of bone marrow multipotential mesenchymal progenitorcells，Arthritis Rheum.46(12)：3349-60中公开的那些。
优选地，间充质干细胞培养物如下制得：用等体积的汉克(Hank′s)平衡盐溶液(HBSS；GIBCO Laboratories，Grand Island，NY，USA)稀释BM抽吸物(aspirate)(通常20ml)，并使所稀释细胞在约10ml Ficoll柱(Ficoll-Paque；Pharmacia，Piscataway，NJ，USA)上分层。以2，500xg，离心30分钟后，从分界面中移出单核细胞层，将其悬浮在HBSS 中。然后以1，500xg离心细胞15分钟，将其重悬在完全培养基(MEM，无脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的α培养基；GIBCO)中；批量选择用于使MSC快速生长的20％胎牛血清(FCS)(AtlantaBiologicals，Norcross，GA)；100单位/ml青霉素(GIBCO)；100μg/ml链霉素(GIBCO)；和2mML-谷氨酰胺(GIBCO)。将重悬细胞接种(涂平板，plate)于10cm培养皿(CorningGlassWorks，Corning，NY)中的约25ml培养基中，并在37℃和5％加湿CO2下温育。培养24小时后，弃去非粘附性细胞，用磷酸缓冲盐水(PBS)充分洗涤粘附细胞两次。每隔3天或4天用新鲜完全培养基更换培养基，持续约14天。然后在37℃下利用0.25％胰蛋白酶和1mM EDTA(胰蛋白酶/EDTA，GIBCO)收获粘附细胞5min，将其重新接种(replate)于6-cm板中，再培养14天。然后使细胞胰蛋白酶化(trypsinize)，并利用细胞计数装置如血球计(Hausser Scientific，Horsham，PA)进行计数。培养的细胞通过离心回收，并用5％DMSO和30％FCS以1～2X106个细胞/ml的浓度重悬。缓慢冷冻每个约1ml等分试样，存放在液氮下。
为了扩增间充质干细胞组分，在37℃下使冷冻细胞解冻(thaw)，用完全培养基稀释并通过离心回收从而除去DMSO。将细胞重悬在完全培养基中，并按约5,000个细胞/cm2的浓度接种。培养24h后，除去非粘附性细胞，利用胰蛋白酶/EDTA收获并通过窄型巴士德移液管(Pasteur pipette)分离(dissociate)粘附细胞，优选以约1.5～约3.0个细胞/cm2的密度重新接种。在这些条件下，MSC培养物可以生长约倍增50次(50population doublings)，并扩增约2000倍[Colter DC，等人，Rapid expansion ofrecycling stem cells incultures of plastic-adherent cells from human bone marrow.Proc Natl Acad SciUSA.97：3213-3218，2000]。
本发明利用的MSC培养物优选包括通过形态特征限定的三组细胞：小的无颗粒细胞(agranular cells)(本文下面称为RS-1)、小的粒细胞(颗粒细胞，granular cells)(本文下面称为RS-2)，以及大的中度粒细胞(moderately granular cells)(本文下面称为成熟MSC)。培养物中此种细胞的存在和浓度可以通过利用例如免疫荧光、原位杂交和活性分析鉴定是否存在各种细胞表面标记来测定。
当在本发明培养条件下培养MSC时，它们对造血干细胞标记CD34、CD11B、CD43和CD45呈阴性染色。少部分细胞(少于10％)对CD31和/或CD38标记呈弱阳性。另外，成熟MSC对造血干细胞标记CD117(c-Kit)呈弱阳性；对成骨MSC标记Stro-1呈中度阳性[Simmons，P.J.&Torok-Storb，B.(1991).Blood 78，5562]，且对胸腺细胞和外周T淋巴细胞标记CD90(Thy-1)呈阳性。另一方面，RS-1细胞对CD117和Strol标记呈阴性，而对CD90标记呈弱阳性，RS-2细胞对所有这些标记都呈阴性。
可用作全细胞膜组分有效来源的其它细胞包括，但不局限于，内皮细胞、肝细胞、胰腺细胞、骨细胞、软骨细胞(chondrocyte)、神经细胞等。
该细胞可以以自然形式使用(used native)(即，未通过基因修饰操纵)或对该细胞进行基因修饰从而操纵该细胞的膜组分。
基因修饰的优点在于其效率提高。基因修饰细胞产生的基本所有(＞95％)CDL都表达感兴趣的基因。该感兴趣的基因可以组成型表达于细胞来源(通过整合到细胞基因组中)或短暂表达(游离型表达(episomal expression))以便避免稳定转染剂(例如，慢病毒和逆转录病毒载体)的有害影响。
因而，该细胞可以经过基因修饰从而表达感兴趣的基因(即，不但表达未天然表达于天然膜中的基因，而且用以增强以较低水平天然表达于该细胞膜上的内源蛋白质的表达)。
根据具体实施方式，感兴趣的基因编码膜蛋白质。感兴趣的基因可以是天然膜蛋白质，或者经修饰从而具有膜锚定所需的膜定位信号和其它基序，如跨膜结构域。
可以异源(外源)表达的膜蛋白质实例包括，但不局限于，靶向蛋白质(例如，抗体、受体、膜锚定配体、诱饵蛋白(诱骗体，decoy))、影响膜化学(性质)的蛋白质(例如，结构蛋白质、带电荷蛋白质)、诊断蛋白质(例如，在以下段落中描述的酶)，和治疗性蛋白质(如在以下段落中描述的)。
靶向部分包括与细胞表面或细胞外基质标记结合的靶向蛋白质，如抗体、受体配体和非蛋白质性分子如碳水化合物。例如，在前列腺癌细胞上过表达的前列腺特异膜抗原(PSMA)可以被它的结合到跨膜基序(例如，截断LIME)4上的配体NAAG3靶向。这可以通过遗传改造该细胞(CDL来源于其中)从而使其表达NAAG的嵌合或自然形式实现。例如，编码LIME的表达质粒通过PCR以及随后将相应片段插入到pcDNA3.1(Invitrogen)中来构建。该引物也具有BamHI(5′引物和3′引物)位点延伸从而使亚克隆容易进行。PCR产物利用BamHI消化并插入到pcDNA3.1(+)(CLONTECH Laboratories，Inc.)中的相应位点处。对于编码LIME-乙酰基天冬氨酰基谷氨酸(NAAG)的表达载体，可以将开放阅读框插入到编码LIME的质粒中，以便NAAG通过其N-端结合并且它的C端保持游离从而与PSMA[即，LIME(C)-(N)NAAG-COOH]反应。替换地，编码NAAG-LIME嵌合体的表达质粒可以按照前面针对CD8-LIME嵌合体5描述的方法构建。与NAAG和LIME跨膜区对应的片段通过PCR产生。对编码NAAG的3’序列和LIME片段的5’序列的引物进行设计从而使其重叠(overlap)，以便使该两种产物退火产生混合模版(hybrid template)。从这个模板，利用包含Xbal位点的外侧引物(external primer)扩增该嵌合体。将NAAG-LIME嵌合体插入pcDNA3.1(+)中。
如本文使用的短语“表面标记”是指被靶细胞/组织的细胞表面或细胞外基质以独特的高密度特异性展示，和/或以独特构型展示的任何化学结构。
例如，靶向部分可能对靶向肿瘤细胞有用。例如，人们通常认为肿瘤细胞的细胞内环境的碱性大于它们邻近的细胞外环境，反过来它们邻近的细胞外环境的酸性大于在滋养肿瘤的新生血管(angiogenic blood vessel)中发现的微环境。另外，许多先前的研究已证明，肿瘤细胞的表面电荷比良性正常细胞的表面电荷的负性更强(more negative)，更不必说侵袭性肿瘤细胞。因此，表达膜结合酶和/或蛋白质可能有用，这将使得仅带正电荷的脂质体位于酸性的肿瘤中间细胞外环境。例如，可以使用落在新生血管高碱性pH(pH＞7.4)和肿瘤邻近的细胞外环境低酸性pH(pH＜7.2)之间pI为约7.2-7.4的任何膜蛋白。此种蛋白质可以通过交叉参考人血浆膜蛋白的RCSB Protein Data Bank(PDB)特异性鉴定。这些蛋白质预期理想的pI(7.2-7.4)可以利用标准迭代算法10，11计算，标准迭代算法将为粗蛋白质序列12，13给出相对精确的PI计算结果。在ExPASy服务器中的Compute pI/Mw工具中运用该算法。预期此种脂质体在新生肿瘤血管碱性微环境中具有负电荷或中性电荷，而在较酸性的肿瘤邻近的细胞外环境中具有正电荷。因此，这种电荷改变对于显著增大中性颗粒负性的脂质体外渗(liposomal extravasation)有利，而且对于更容易利用带正电荷 颗粒完成的肿瘤内递送有利8，14，15。
关于在疾病如癌症中特异性过表达的表面标记以及对此种表面标记有特异性的抗体的详尽指导记载在现有技术的文献(例如，参考：AM Scott，C Renner.″TumourAntigens Recognised by Antibodies.″，Encyclopedia of Life Sciences，NaturePublishing Group，Macmillan，London，UK，www.els.net，2001)中。
与特异性展示生长因子受体/TAA表面标记的靶细胞/组织关联的，可通过本发明方法治疗的疾病包括，例如，特异性展示生长因子受体/TAA的许多疾病中的一些，所述的生长因子受体/TAA为，例如EGF受体、血小板来源的生长因子(PDGF)受体、胰岛素样生长因子受体、血管内皮生长因子(VEGF)受体、成纤维细胞生长因子(FGF)受体、转铁蛋白受体，和叶酸受体。此种疾病和这些疾病特异性展示的生长因子受体/TAA的具体实例在下表1中列出。
表1
*缩写：EGF-表皮生长因子，PDGF-血小板来源的生长因子，IGF-胰岛素样生长因子，VEGF-血管内皮生长因子，FGF-成纤维细胞生长因子。
在优选实施方式中，该配体是靶向对靶细胞上的受体有特异性的抗原的抗体或抗体片段。抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体或抗体片段，它们是靶特异性的。在实施方式中，附连到脂质体上的抗体是特异性结合到B-细胞表位上的抗-CD19、抗-CD20，或抗-CD22。这些抗体或抗体片段通常源自对受累(affected)B-细胞表现出阳性反应性的杂 交瘤。考虑到，可以类似地使用靶向身体中任何其它细胞的其它抗体或抗体片段。例如，利用抗-CD19抗体使含有包埋剂(entrapped agent)的脂质体靶向恶性B细胞。该抗体识别B细胞上的独特(unique)表位，CD19表面抗原。
在真核细胞中表达异源蛋白质的方法是本领域熟知的。
因而，可以在后来从中抽提膜的细胞中表达设计和构建用于表达感兴趣的基因至少一个功能部分的外源多核苷酸序列。相应地，该外源多核苷酸序列可以是感兴趣的基因的DNA或RNA序列。
如本文使用的术语“功能部分”是指表现出酶功能特性如与底物结合的特性的编码蛋白质(即，多肽)的部分。例如，抗体功能部分可以是赋予特异性的可变区和另外的恒定区/或者替换地为恒定区，即，Fc，其可以活化补体(complement)和诱导细胞杀伤。例如，细胞可以利用编码GPCR家族一个或多个成员(例如，CCR5、CXCR4等)的基因转染，该基因将使脂质体靶向包括自身免疫性疾病和病毒疾病(例如HIV/AIDS)在内的大量细胞病状。
为了在真核(例如，哺乳动物)细胞中表达外源感兴趣的基因，优选将编码感兴趣的基因的多核苷酸序列连接到适合于真核细胞表达的核酸构建体中。此种核酸构建体包括用于指导该多核苷酸序列在细胞中以组成型或诱导型方式转录的启动子序列。
适合于本发明使用的用于哺乳动物表达的组成型启动子是在大多数环境条件下和在大多数类型的细胞如巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)和劳斯肉瘤病毒(RSV)中有活性的启动子序列。适合于本发明使用的诱导型启动子包括例如，四环素可诱导的启动子的诱导型启动子(Zabala M等人，Cancer Res.2004，64(8)：2799-804)。
本发明核酸构建体(在本文也称为“表达载体”)包括使这种载体适合于在原核生物、真核生物或优选二者(例如，穿梭载体)中复制和整合的另外序列。另外，典型的克隆载体还可以包含转录和翻译起始序列、转录和翻译终止子以及多腺苷酸化信号。举例来说，此种构建体通常包括5′LTR、tRNA结合位点、包装信号、第二链DNA合成起点，以及3′LTR或其部分。
本发明核酸构建体通常包括指导翻译的多肽到达膜的信号序列，另外包括膜锚定结构域如跨膜结构域或基于脂质的锚(anchor)(例如GPI)。
真核启动子通常包含两种类型的识别序列，TATA框和上游启动子元件。TATA框，位于转录起始位点上游的25-30位碱基对处，被认为参与指导RNA聚合酶开始RNA的合成。其它上游启动子元件决定转录起始速率。
优选地，本发明核酸构建体利用的启动子在转化的特异细胞群体中有活性。细胞类型特异性和/或组织特异性启动子的实例包括这样的启动子如肝特异性白蛋白[Pinkert等人，(1987)Genes Dev.1：268-277]、淋巴特异性启动子[Calame等人，(1988)Adv.Immunol.43：235-275]；特别是T细胞受体启动子[Winoto等人，(1989)EMBO J.8：729-733]和免疫球蛋白[Banerji等人(1983)Cell 33729-740]；神经元特异性启动子如神经微丝(neurofilament)启动子[Byrne等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：5473-5477]、胰腺特异性启动子[Edlunch等人(1985)Science 230：912-916]或乳腺特异性启动子如乳清(milk whey)启动子(美国专利No.4,873,316和欧洲申请公开No.264,166)。
与同源或异源启动子连接时，增强子元件可刺激转录提升至1,000倍。增强子在处于转录起始位点的上游或者下游的时候具有活性。源自病毒的许多增强子元件具有宽广的宿主范围，并在多种组织中有活性。例如，SV40早期基因增强子适合于许多细胞类型。适合于本发明的其它增强子/启动子组合包括源自多瘤病毒、人或鼠巨细胞病毒(CMV)的那些，以及来源于各种逆转录病毒如鼠白血病病毒、鼠或Rous肉瘤病毒和HIV的长末端重复序列。参见Enhancers and Eukaryotic Expression，Cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarbor，N.Y.1983，该文献通过引用合并在此。
在构建表达载体时，优选将启动子与异源转录起始位点的距离设置成与该启动子在自然环境下与转录起始位点的距离近似相同。然而，如本领域熟知的，在不损害启动子功能的情况下可以对这个距离作出各种改变。
也可将多腺苷酸化序列加入到表达载体中以便增加mRNA翻译的效率。准确高效的多腺苷酸化需要2个不同的序列元件：位于多腺苷酸化位点下游的GU或U富含序列，和位于上游核苷酸11-30之间的六个核苷酸高度保守序列AAUAAA。适合于本发明的终止和多腺苷酸化信号包括源自SV40的那些。
除已描述的元件以外，本发明表达载体通常还可以包含其它旨在增大所克隆核酸的表达水平或使携带重组DNA的细胞易于鉴定的特定元件(specialized element，专用元件)。例如，许多动物病毒包含促进病毒基因组在容许细胞类型中进行染色体外复制的DNA序列。携载这些病毒复制子的质粒可以游离型复制(replicated episomally)，只要质粒上携带的基因或宿主细胞基因组的基因能够提供合适的因子即可。
该载体可以包括或不包括真核复制子。如果存在真核复制子，则该载体可利用合适的可选择标记在真核细胞中扩增。如果该载体不包含真核复制子，则无法进行游离型扩增。相反，重组DNA整合到工程细胞的基因组中，其中启动子指导期望核酸的表达。
本发明表达载体可以进一步包括如允许从单一mRNA如内核糖体进入位点(IRES)翻译几种蛋白质的另外多核苷酸序列和使启动子嵌合多肽基因组整合的序列。
哺乳动物的表达载体的实例包括，但不限于，可从Invitrogen获得的pcDNA3、pcDNA3.1(+/-)、pGL3、pZeoSV2(+/-)、pSecTag2、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto、pCR3.1、pSinRep5、DH26S、DHBB、pNMT1、pNMT41、pNMT81，可从Promega获得的pCI，可从Strategene获得的pMbac、pPbac、pBK-RSV和pBK-CMV，可从Clontech获得的pTRES，以及它们的衍生物。
也可以使用包含真核病毒如慢病毒和反转录病毒的调节元件的表达载体。SV40载体包括pSVT7和pMT2。源自牛乳头瘤病毒的载体包括pBV-1MTHA，且源自艾伯斯坦-巴尔病毒(Epstein Bar virus)的载体包括pHEBO和p205。其它示例载体包括pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE，和允许蛋白质表达在SV-40早期启动子、SV-40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、Rous肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子(polyhedrin promoter)或表现为对真核细胞中的表达有效的其它启动子指导下进行的任何其它载体。
替换地，可以对细胞、膜、空胞或CDL(其中的任何一个可以是天然形式的或基因修饰的)进行化学处理以便呈递蛋白质、糖、合成聚合物、肽或它们的任何组合。本文下面和后面实施例部分描述了用合成聚合物修饰膜的方法。此种化学连接可以在从活的培养或 悬浮细胞到产生的CDL的任何阶段下进行。
例如，也可以使CDL与可进一步增强它们靶向和附连到肿瘤细胞的能力的叶酸盐(酯)(folate)化学结合，已知肿瘤细胞相比良性细胞表达较高水平的叶酸盐(酯)受体。
根据另一个实例，也可以永久性地调节CDL从而使其具有正性更强的表面电荷，通过用阳离子、盐或聚阳离子(例如聚乙烯亚胺和聚-L-赖氨酸)处理它们，使得它们具有正性更强的电荷从而更好地靶向肿瘤新生血管。
也可以在CDL表面引入非自然材料，通过与可由良好界定的脂质、蛋白质和添加剂组成的其它脂质体(例如，细胞来源或合成的脂质体)融合(例如，PEG或清洁剂(去污剂)诱导的)实现。此种融合可以产生混合CDL，可用来使任何部分(例如，靶向、治疗、诊断、致使隐形(stealth-rendering)的部分，等)结合到CDL上和改变它们的表面特性。脂质体融合的进一步指导参见实施例5。
合成聚合物通常用来阻止或减少凝聚(coagulation)，增大分散性，降低与血液组分的相互作用，避开单核吞噬系统的非特异性摄取和在很大程度上延长颗粒循环时间，从而使该脂质体具有通常称为隐形特性的特性和特征或为长循环脂质体。因此，颗粒表面处纳米环境的pH也可能取决于这些分子的长度。
有许多聚合物可以附连到脂质上。通常用作脂质修饰剂的聚合物包括，不局限于，聚乙二醇(PEG)、聚唾液酸、聚乳酸(也称为多乳酸化合物(polylactide))、聚乙醇酸(也称为聚乙交酯(聚乙醇酸交酯))、聚乳酸-聚乙醇酸的聚乙烯醇(apolylactie-polyglycolicacid′polyvinyl alcohol)、聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羟基乙基噁唑啉(polyllydroxyetlyloxazolille)、聚羟基丙基噁唑啉(solyhydroxypryloxazoline)、聚天冬酰胺(polyaspartarllide)、聚羟丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚乙烯基甲基醚、聚羟乙基丙烯酸酯、衍生化纤维素如羟甲基纤维素或羟乙基纤维素。
所采用的聚合物可以为均聚物或者为嵌段或无规共聚物。
衍生为脂质聚合物的最常用市售脂质是基于磷脂酰乙醇胺(PE)的那些，通常为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)。
可被本发明采用的脂质聚合物的特异性家族包括其中PEG聚合物经由氨基甲酸酯键连接到脂质上的PEG-DSPE(具有不同长度的PEG链)，和聚乙二醇二硬脂酰甘油。该PEG部分头基的分子量优选为约750Da～约20,000Da。更优选地，该分子量为约750Da～约12,000Da，最优选为约1,000Da～约5,000Da。两种示例性DSPE-PEG为其中PEG分子量为2000Da和5000a的那些，它们在本文称为DSPE-PEG(2000)(DSPE-PEG2k)和DSPE-PEG(5000)(DSPE-PEG5k)。
也可以被本发明采用的脂质聚合物的特异性家族包括C8和C16mPEG神经酰胺(具有不同长度的PEG链)，其中PEG-神经酰胺在PEG和神经酰胺部分之间含有使该化合物容易代谢的酯键。该PEG部分头基的分子量优选为约750Da～约2,000Da。更优选地，该分子量为约2,000Da。
常见脂质体的常规插入后PEG化需要加热或溶解在含有可能会损害表面蛋白质并导致包封泄漏的溶液的清洁剂中。因此，CDL也可以通过下面描述的两种方法或其组合进行PEG化。首先，通过清洁剂透析将PEG化脂质掺入空胞细胞膜(在制备CDL之前)制 备PEG化CDL。接着，可以利用琥珀酰亚胺基琥珀酸酯活化的单甲氧基-PEG执行CDL的直接PEG化，这种PEG化已被证明可增大转染效率和降低血清介导的用作基因转导载体的PEG化慢病毒颗粒失活16。
可以采用非蛋白质组分(例如，合成聚合物、碳水化合物等)与脂质体表面的化学结合。因而，可以利用本领域已知的任何连接或结合方法和/或任何合适的化学连接子，使非蛋白质部分共价或非共价连接到、嵌入或吸附到脂质体上。此种交联剂及交联方法的确切类型和化学性质优选适合于所用亲和基团的类型和脂质体的性质。结合或吸附或连接酶和/或靶向部分的方法在本领域中也是熟知的。
例如，酶和/或靶向部分可以在界面附连到基团上，通过，但不局限于，极性基团如氨基、SH、羟基、醛、甲酰基、羧基、His-标签或其它多肽。另外，酶和/或靶向部分可以通过，但不局限于活性基团如琥珀酰亚胺基琥珀酸酯、氰尿酰氯、甲苯磺酰基活化的基团、咪唑基、CNBr、NHS、活化的CH、ECH、EAH、环氧基、硫丙基、活化的硫醇等附连。而且，酶和/或靶向部分可以通过，但不局限于可以包括或不包括交联剂(例如，二价阴离子、聚阴离子、聚阳离子等)的疏水键(范德华力)或静电相互作用附连。
一旦细胞来源可用，就制备脂质体。因而，提供了生产脂质体的方法，包含：
(a)将细胞置于低渗条件下，以便获得破裂的细胞膜和/或空胞细胞(也称为空胞(ghost))；和
(b)使破裂的细胞膜和/或空胞均质化从而产生脂质体。
该方法可以利用本领域中其它广为接受的方案实施，如下面文献中描述的并加以修改或未加以修改的那些：Boone，C.W.，Ford，L.E.，Bond，H.E.，Stuart，D.C.&Lorenz，D.Isolation of plasma membrane fragments from HeLa cells.J Cell Biol 41，378-392(1969)；和Westerman and Jensen Methods Enzymol.2003；373：118-27(其中的每篇文献都通过引用合并在此)。
如本文使用的术语“空胞”是指，所有细胞质内容和/或细胞核都通过细胞裂解和/或膜破裂除去以便仅残留其外面的细胞质/细胞膜的细胞；和
不受特定方案束缚，在特定实施方式中建议本发明脂质体以分步方式制备。首先，主要利用低渗处理从细胞(109个细胞)中分离质膜，使得细胞破裂和空胞细胞形成。替换地，空胞细胞可以利用温和超声波法、冻融法、弗氏压碎器(French-press)、针通过(needle-passaging)或含清洁剂溶液溶解法形成。根据具体实施方式，低渗处理在Tris-镁缓冲液(例如，在4℃下pH 7.4或pH 8.6，用HCl调节pH)中进行。通过位相显微术(相差显微检查，phase-contrast microscopy)监视细胞溶胀(cell swelling)。一旦细胞溶胀并有空胞形成，就将悬浮液放入均质机。通常，约95％细胞破碎已足够。然后将膜/空胞放入蔗糖(0.25M或更高)中保存。为了避免粘附，将空胞放入塑料管中并进行离心。产生层叠球粒(laminated pellet)，其中最上面较浅的灰色层仅由空胞组成。但为了增大产量对全部球粒加以处理。离心(例如，4℃下以3,000rpm离心15min)和洗涤(例如，20体积的Tris镁/TM-蔗糖pH 7.4)可以重复进行。
在下一个步骤中，通过在不连续的蔗糖密度梯度中浮选(floatation)分离空胞组分。将少量过量的上清液置于洗涤的球粒上，该球粒此时包含空胞、细胞核和不完全破裂的全细胞。在悬浮液中另外加入pH为8.6的含60％w/w蔗糖的TM从而在折射计(refractometer)上给出45％蔗糖的读数。这个步骤之后，所有溶液都含有pH 8.6的TM。将15ml悬浮液放入SW-25.2硝酸纤维素管，并通过加入分别由40％和35％w/w蔗糖组成的15ml层，然后加入5ml TM-蔗糖(0.25M)在该悬浮液上形成不连续梯度。此时在4℃下以20,000rpm离心该材料10min。细胞核沉积物形成球粒，不完全破裂的全细胞聚集在40％-45％界面处，空胞聚集在35％-40％界面处。收集空胞并汇集在一起。
在下一个步骤，通过超声处理使空胞均质化，超声处理后可以接着进行挤出。
具体的超声处理方案涉及利用振幅设置(amplitude)为8，带有微探针的MSE超声处理器(Instrumentation Associates，N.Y.)超声处理5秒。这个短暂的超声处理时间足以使空胞质膜分解为细胞来源的脂质体(CDL)。在这些特定条件下，细胞器膜未被破坏并通过离心(3,000rpm，15min 4℃)除去。然后通过在连续蔗糖密度梯度中沉积纯化质膜囊泡(CDL)。
包含本发明一种或多种药剂的脂质体的尺寸范围优选为20-1000nm例如，30-1000nm、0.02-1.0μm，更优选0.05-1.0μm，更优选0.07-0.5μm且更优选0.1-0.3μrn。较小或约0.2μm的脂质体的优点在于，它们容易渗透通过肿瘤血管系统(由于EPR效应)，它们不容易被巨噬细胞摄取且它们可以经受过滤灭菌。
通过市售聚碳酸酯膜(例如，购自华盛顿Sterlitech)或购自法国Pall Execia的不对称陶瓷膜(例如，Membralox)挤出脂质体是将脂质体尺寸减小到相对明确限定的尺寸分布的有效方法。通常，使该悬浮液通过该膜循环一次或多次直至获得期望的脂质体尺寸分布。可以通过连续变小孔隙的膜(例如，孔隙尺寸为400nm、100nm和/或50nm)挤出脂质体从而使脂质体尺寸逐渐减小并获得均匀分布。
在均质化、超声处理和/或挤出之前的任何步骤，即，通常在空胞制备之后，将药剂加入反应混合物中以便所形成的脂质体包封该药剂。
如本文使用的短语“药剂”是指可用来治疗或诊断医学病况的治疗剂或诊断剂。
根据具体实施方式，当细胞来源是间充质干细胞时，包含药剂和脂质体的组合物是低免疫原性或非免疫原性的。
因而，本发明脂质体可以具有吸附到其表面上或者包封在其中，包封在脂质体内极性相内或包封在层状非极性脂质相内的药剂。
使分子(例如，靶向部分、药剂、合成聚合物等)结合到脂质体上的方法在本领域中是熟知的。例如，可以基于疏水相互作用(范德华力结合)或静电相互作用，利用或不利用交联剂(例如，阴离子或聚阴离子)，使药剂(或任何其它分子)附连、结合或吸附到脂质体、空胞或脂质体来源于其中的细胞表面上。可以利用或不利用清洁剂和/或通过清洁剂透析(detergent dialysis)，使疏水和/或两性药剂(或任何其它疏水和/或两性分子)溶解、部分溶解或分配(partition)到细胞、空胞或脂质体脂质膜中。药剂(或任何其它分子)可以基于与活性基团形成的共价键附连、结合或吸附到脂质体、空胞或者脂质体来源于其中的细胞的表面上。药剂可以附连、结合或吸附到该脂质体、空胞或者细胞的表面上，作为被在脂质体、空胞或细胞上发现的天然部分特异性识别的抗体或其部分的结合物。例如，药剂可以通过但不局限于下面这些基团吸附到脂质体表面(内部或外部)：极性基团如氨基、SH、羟基、醛、甲酰基、羧基、His-标签或其它多肽。另外，药剂可以通过，但不局限于活性基团如琥珀酰亚胺基琥珀酸酯、氰尿酰氯、甲苯磺酰基活化的基团、咪唑基、CNBr、NHS、 活化的CH、ECH、EAH、环氧基、硫丙基、活化的硫醇等附连。
包埋在脂质体内，吸附、表达、结合、附连和/或溶解在脂质体表面或膜上的治疗剂是通过，但不局限于下列机制中的一种或多种机制递送到靶细胞和/或组织中：
药剂通过脂质体和细胞之间膜融合的直接细胞内递送，和/或脂质体通过内吞作用、吞噬作用或任何一种跨膜运送机制被摄取。
药剂从脂质体扩散和/或泄漏，并随后结合到靶细胞/组织的表面，和/或通过扩散、内吞作用、吞噬作用或通过任何一种跨膜运送机制被靶细胞/组织摄取。
永久性、连续性或短暂性表达、附连、吸附、结合和/或溶解在脂质体表面或膜上的药剂结合到靶细胞和/或组织的表面。
多种治疗剂可以包埋在脂质囊泡中，包括可以稳定地包封在脂质体水性隔室中的水溶性药剂、稳定分配在该囊泡的液相中的亲脂性化合物，或可以例如通过静电、共价或疏水相互作用稳定或短暂附连、结合、吸附或表达在脂质体外表面或内表面上的药剂。
示例水溶性化合物包括小分子(即，低于1000道尔顿)或大分子(例如，超过1000道尔顿)、生物分子(例如，蛋白质性分子，包括但不局限于肽、多肽、翻译后修饰的蛋白质、抗体等)或核酸分子(例如，双链DNA、单链DNA、ds/ss RNA(例如，siRNA、反义、核酶)，或三螺旋核酸分子或化学物。治疗剂可以是源自任何已知生物(包括但不局限于动物、植物、细菌、真菌、原生生物或病毒)或源自合成分子文库的天然产物。治疗剂可以是单体化合物和多聚体化合物。
如上所述，该治疗剂可以是蛋白质，如补偿内源性酶，如不足会导致Tay-Sachs病的酶己糖胺酶A的活性降低或表达低下的酶。
可以穿过血屏障递送到脑、眼、睾丸或乳腺的治疗剂实例包括，但不局限于，抗生素药剂、抗肿瘤药剂、消炎药剂、抗寄生虫药剂、抗真菌药剂、抗分支杆菌药剂、抗病毒药剂、抗凝血剂、放射治疗剂、化疗药剂、细胞毒性药剂、细胞生长抑制剂、血管扩张剂、抗氧化剂、兴奋剂、抗惊厥剂、抗组胺剂、神经营养药剂、心理治疗剂、抗焦虑镇静剂、刺激剂、镇静剂、镇痛剂、麻醉剂、节育剂、神经递质药剂、神经递质模拟剂(neurotransmitter analogagent)、净化剂(scavenging agent)和生育增强剂。
脂质体包埋的化合物也可以是诊断剂如显像剂或造影剂(contrast agent)如铟和锝，酶如辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶，含有钆的MRI造影介质，含有碘的X射线造影介质，超声造影介质(ultrasonography contrast media)如CO2，铕衍生物，荧光物质如羧基荧光素和照明剂(发光体，illuminant)如N-甲基吖啶盐(N-methylacrydium)衍生物。
一旦形成脂质体(即，带有或不带有药剂)，就可以对它们的尺寸分布、组成、浓度、Z电位、表面电位(electrical surface potential)、表面(局部)pH、蛋白质与脂质的比率，以及体外和体内的治疗功效进行表征。
本发明实验测试的脂质体具有下表2中描述的下列尺寸值：
表2
空脂质体或者包含本发明一种或多种药剂的脂质体的尺寸范围优选为30-3000-nm，更优选50-500nm，更优选30-300nm，更优选50-200nm，且更优选70-150nm。较小或约100-nm的脂质体的优点在于它们能够渗透通过非常狭窄的血管，这对于诊断和治疗非常重要。
可以利用本领域中已知的任何方法测定脂质体的尺寸。例如，可以使用利用激光光散射的Nicomp Submicron Particle Sizer(370型号，Nicomp，Santa Barabara，Calif.)。测量脂质体尺寸的其它方法包括光子相关光谱法、激光衍射法、小角激光光散射法(LALLS)、中角激光光散射法(MALLS)、光阻法(light obscuration)(例如Coulter法)、流变学，或显微术(光或电子)。优选的有效平均颗粒尺寸取决于这些因素，如该化合物的预期给予途径、剂型(formulation)、溶解性、毒性和生物利用率。
下面提供了实验测试的脂质体的Z电位值。未PEG化的CDL：-17.9～-15.5mV。
PEG化(空胞-间接)：-13.2mV。PEG化(CDL-直接)：-10.2mV。
因而，本发明脂质体的特征为：其在未PEG化时的z电位为-20～-15mV，其在PEG化时的Z电位为-15～-10mV。
如所述的，本发明脂质体有利地用于临床中。
因而，根据本发明的方面提供了递送药剂的方法，该方法包含给需要其的对象给予上述脂质体，其中该药剂包封在其中或者吸附在其上，从而递送该药剂。
根据实施方式，该细胞是靶细胞，且该脂质体包含靶向部分，该靶向部分是如上所述化学结合的、异源添加的，或自然存在于脂质体由其构成的膜中(例如，如在向肿瘤细胞迁移的MSC中)。
该脂质体的细胞来源可以是对象自体或非自体的(例如，异体、异种)。
本文提到的“靶细胞”是将利用脂质体向其中递送物质的细胞或细胞簇(同源或异源群体的细胞簇)和/或组织。其实例包括癌细胞、血管新生癌组织的血管内皮细胞、癌症干细胞、癌症组织的间质细胞、受累于遗传异常的细胞、受病原体感染的细胞等。“靶分子”可以是呈递在靶细胞或与靶细胞相邻的细胞表面上的任何分子。靶分子的另一种形式包括由细胞释放的分子。其实例包括细胞外基质组分、癌细胞或癌组织间质细胞的分泌物或架构(architecture)，且其具体实例包括肿瘤标记、细胞之间的结构等。
递送可以出于诊断原因(例如，该脂质体包括诊断剂)或出于治疗目的(即，作为递送治疗剂的药物递送工具)。
该脂质体可以单独(自身)地或者作为药物组合物的一部分给予给对象。
如本文使用的“药物组合物”是指含有本文描述的一种或多种活性成分和其它化学组分如生理上适合的载体和赋形剂的制剂。药物组合物的目的在于使活性成分容易给予对象。
本文的术语“活性成分”是指可引起生物效应的治疗剂(带有或不带有脂质体)。应理解，该脂质体本身可以具有免疫调节功能，如当由MSC膜或其它免疫调节细胞(例如，免疫B和T淋巴细胞等)制备时。还应理解，由于与靶细胞膜融合以及随后对细胞膜、细胞 骨架和功能造成破坏，该脂质体本身可以对靶细胞有细胞毒效应。在此种情况下，采用加入靶向部分的措施以便使该细胞毒效应变得有特异性。
下文中，短语“生理可接受载体”和“药物可接受载体”可以互换使用，是指不会给对象造成显著的刺激性而且不会消除所给予活性成分的生物活性和特性的载体或稀释剂。佐剂包含在这些术语中。
本文中，术语“赋形剂”是指加入到药物组合物中从而进一步使本发明活性成分容易给予或者增大保存期稳定性的惰性物质。赋形剂的实例包括，但不局限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖类和盐类及各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油、EDTA、EGTA、聚-L-赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚凝胺(polybrene)(溴化己二甲胺)、聚乙二醇和其它聚或单一阴离子。该药物组合物可以有利地采用泡沫、气溶胶或凝胶形式。
药物的调配和给予技术可以在“Remington’s Pharmaceutical Sciences，”MackPublishing公司，Easton，PA，最新版中找到，该文献通过引用合并在此。
合适的给予途径包含各种合适的全身和/或局部给予途径中的任一种。
合适的给予途径可以，例如包括吸入、口服、颊部、直肠、经粘膜、外用、经真皮、真皮内、经鼻、肠和/或肠胃外途径；肌内、皮下和/或髓内注射途径；鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内和/或眼内注射途径、利用或不利用血管造影球囊(angio balloon)的导管插入术(Catheterization)，和/或直接注射到对象组织区域中的途径。
该药物组合物可以通过本领域熟知的工艺制造，如通过常规的混合、溶解、造粒、包糖衣、研粉(levigating)、乳化、制成胶囊、包埋或冷冻干燥(冻干)工艺。
根据本发明使用的药物组合物可采用常规方法利用一种或多种使活性成分容易加工成可以药用的制品、包含赋形剂(excipient)和辅助物(辅剂，auxiliary)在内的生理可接受载体调配。合适的剂型取决于所选的给予途径。
对于注射，该药物组合物的活性成分可以调配在水溶液中，优选在生理相容性缓冲液如汉克溶液、林格氏溶液，或生理盐缓冲液中。
对于经粘膜给予，在配方中使用适合于待渗透屏障的穿透剂(penetrant)。此种穿透剂一般在本领域中是已知的。
对于口服给予，该药物组合物可以容易地通过将活性成分与本领域熟知的药物可接受载体结合而调配。此种载体使该药物组合物能够调配成供病人口服摄取的片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆剂、浆液、混悬剂等。口服使用的药物制品可利用固体赋形剂制造，可选地研磨所得混合物，需要时可加入合适的辅助物并在此后对颗粒混合物进行处理，从而获得片剂或糖衣核。合适的赋形剂为，特别是，填充剂如糖类，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇，纤维素制品如，玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍树胶、甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、羧甲基纤维素钠，和/或生理上可接受的聚合物如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可加入崩解剂，如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂，或海藻酸或其盐如海藻酸钠。
糖衣核(dragee core)具有合适的包衣。为此目的，可使用浓缩的糖溶液，其可以可选地包含阿拉伯树胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇、二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可将染料或色素加入到片剂或糖衣丸包衣中，以便鉴定或表征不同的活性化合物剂量组合。
可口服使用的药物组合物，包括明胶制成的推入配合胶囊(push-fit capsule)，以及由明胶和增塑剂如甘油或山梨醇制成的密封软胶囊。推入配合胶囊可包含与填充剂如乳糖、粘合剂如淀粉、润滑剂如滑石粉或硬脂酸镁，和可选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性成分可以溶解于或悬浮于合适的液体中，如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇中。另外，可加入稳定剂。所有口服给予的制剂的剂量应适合于所选的给予途径。
对于颊部给予，该组合物可采用按常规方法调配的片剂或含片的形式。
对于通过吸入途径给予，根据本发明使用的活性成分可以气溶胶/喷雾形式递送，该气溶胶/喷雾是从加压包或喷洒器，借助于合适的抛射剂(推进剂，propellant)，例如氟氯烃如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷，二氧化碳，或挥发性烃如丁烷、丙烷、异丁烷或其混合物呈递的。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可通过提供用于递送计量的量的阀门确定。可将用在分配器中的例如明胶制成的胶囊和药筒(cartridge)，调配成包含该活性成分与合适的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。
该药物组合物可以调配用于肠胃外给予，例如通过推注或连续输注给予。注射用制剂可以单位剂量的形式呈递，如，在安瓿或在多剂量容器中，其中可选地加入防腐剂。该组合物可以是油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液，或乳液，并可包含调配剂如悬浮剂、稳定剂，和/或分散剂。
用于肠胃外给予的药物组合物可以包括水溶性形式的活性成分水溶液。另外，可将该活性成分的悬浮液配制成适当的油性或基于水的注射悬浮液。合适的亲脂溶剂或媒介物包括脂肪油如芝麻油，或合成的脂肪酸酯如油酸乙酯、甘油三酯或脂质体。水性注射悬浮液可包含增大悬浮液粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇，或葡聚糖。可选地，该悬浮液还可包含合适的稳定剂或增大活性成分的溶解度从而允许制备高度浓缩的溶液的试剂。
替换地，该活性成分可以是粉末形式，在使用前用合适的媒介物如无菌的基于无热源水的溶液进行配制。
该药物组合物还可利用如常规栓剂基质如可可豆油或其它甘油酯，调配成直肠组合物如栓剂或保留灌肠剂(retention enemas)。
该药物组合物应包含对治疗疾病有效的量的活性成分。
治疗有效量的确定完全在技术人员的能力范围内，尤其是在阅读本文提供的详细公开内容之后。
对于本发明方法中使用的任何制剂，治疗有效量或剂量可以根据体外和细胞培养物和体内分析加以评价。例如，可以在动物模型中调配剂量从而获得期望的浓度或滴度(滴定度，titer)。此种信息可以用于更准确地确定对人有用的剂量。
本文描述的活性成分的毒性和治疗效能可通过体外、细胞培养物或实验动物中的标准药物程序来确定。可利用从这些体外和细胞培养物分析及动物研究中获得的数据，调配用于人的剂量范围。该剂量可随着采用的剂型和利用的给予途径而改变。确切的制剂、给予途径和剂量可由个人医生根据患者的病况加以选择(参见如Fingl等人，1975，″ThePharmacological Basis of Therapeutics″，Ch.1p.1)。
剂量和时间间隔可单独地调整从而为血浆或脑提供足以获得期望治疗效果的水平的活性成分(最低有效浓度，MEC)。对于每种制剂，MEC有所不同，但可根据体外数据评价。达到MEC所需的剂量取决于个体特征和给予途径。可利用检测试验测定血浆浓度。
根据受治疗病况的严重性和反应(responsiveness)，可进行单剂量或多剂量给予，持续几天至几周的治疗疗程，或直到实现治愈或病情减轻。
该组合物的给予量将取决于受治疗对象、疼痛严重性、给予方式，处方医生的判断等。
本发明组合物如果需要可放置在包装或分配装置，如FDA批准的试剂盒中，其可包含含有活性成分的一种或多种单位剂量形式。该包装可包含，例如，金属或塑料箔，如泡罩包装(blister pack)。该包装或分配器装置还可附有给予说明。该包装或分配器还可提供与该容器相关的由管理药物制造、使用或销售的政府部门所规定的形式的通知，该通知证明了该组合物的形式或人用或兽用已被政府部门批准。此通知，例如，可以是美国食品和药品管理局对于处方药批准的标签或者是已批准的产品插页。
如本文使用的术语“约”是指±10％。
术语“包含”、“包含的”、“包括”、“包括的”、“具有”，和它们的词形变化形式意思是指“包括但不局限于”。
术语“由……组成”是指“包括并限于”。
术语“基本上由……组成”意思是指组合物、方法或结构可包括另外的成分、步骤和/或部分，但仅该另外的成分、步骤和/或部分不能实质性地改变要求保护的组合物、方法或结构的基本特征和新特征。
如本文使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代，除非上下文另有明确规定。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包括其混合物。
在整篇专利申请中，本发明的各种实施方式可以范围形式呈现。应当理解范围形式的描述仅是为了方便和简洁，而不应该理解为对本发明范围的硬性限制。因此，范围的描述应视为已具体地公开了所有可能的子范围以及在此范围内的各个数值。例如，如从1至6的范围描述应视为已具体地公开了诸如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等的子范围，以及在此范围中的各个数值，例如，1、2、3、4、5，和6。不论范围宽度如何，这都能适用。
当本文中指出了数值范围时，其意在包括在所指范围内的任何提及数字(分数或整数)。本文中的表达在第一个指定数和第二个指定数之间的“范围”与从第一个指定数“至”第二个指定数的“范围”可互换使用，意在包括第一和第二个指定数及其间的所有分数和整数。
如本文使用的术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、方法、技术和程序，包括但不限于，化学、药学、生物学、生物化学和医学领域技术人员已知，或易于从已知方式、方法、技术和程序开发出的那些方式、方法、技术和程序。
如本文使用的术语“治疗”包括消除、基本上抑制、减慢或逆转病况的进展，基本上改善病况的临床或美学(aesthetical)症状或者基本上阻止病况的临床或美学病况的出现。
应理解，为清楚起见而在单独实施方式的上下文中描述的本发明某些特征，也可结合提供在单个实施方式中。相反，为简洁起见而在单个实施方式的上下文中描述的本发明的多种特征，也可单独地或以任何合适的子组合形式，或作为适合于本发明的任何其他被描述的实施方式提供。在各个实施方式的上下文中描述的某些特征不应被认为是这些实施方式的必需特征，除非这些实施方式没有这些元素(元件)时是无效的。
如上文所描绘的和如下面权利要求部分所要求保护的本发明的各种实施方式和方面将在下面的实施例中找到实验支持。
实施例
现在参考下面的实施例，结合上面的描述以非限制方式阐述本发明的一些实施方式。
一般地，本文使用的术语和本发明利用的实验操作程序包括分子、生物化学、微生物学，和重组DNA技术。此类技术在文献中有详尽的解释。参见，例如，″Molecular Cloning：A laboratory Manual″Sambrook等人，(1989)；″Current Protocols in MolecularBiology″卷I-III Ausubel，R.M.，ed.(1994)；Ausubel等人，″Current Protocols inMolecular Biology″，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，″APractical Guide toMolecular Cloning″，John Wiley&Sons，New York(1988)；Watson等人，″Recombinant DNA″，Scientific American Books，New York；Birren等人(eds)″Genome Analysis：A Laboratory Manual Series″，卷1-4，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York(1998)；如美国专利No.4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中列出的方法；″Cell Biology：A Laboratory Handbook″，卷I-IIICellis，J.E.，ed.(1994)；″Current Protocols in Immunology″卷I-III Coligan J.E.，ed.(1994)；Stites等人(eds)，″Basic and Clinical Immunology″(第8版)，Appleton&Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell and Shiigi(eds)，″Selected Methods in CellularImmunology″，W.H.Freeman and Co.，New York(1980)；可用的免疫分析法详述在专利和科学文献中，参见，例如，美国专利No.3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；″Oligonucleotide Synthesis″Gait，M.J.，ed.(1984)；″Nucleic Acid Hybridization″Hames，B.D.，and Higgins S.J.，eds.(1985)；″Transcription and Translation″Hames，B.D.，and Higgins S.J.，Eds.(1984)；″Animal Cell Culture″Freshney，R.I.，ed.(1986)；″Immobilized Cells andEnzymes″IRL Press，(1986)；″A Practical Guide to Molecular Cloning″Perbal，B.，(1984)and″Methods in Enzymology″卷1-317，Academic Press；″PCR Protocols：A GuideTo Methods And Applications″，Academic Press，San Diego，CA(1990)；Marshak等人，″Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory CourseManual″CSHL Press(1996)；其中的所有文献都通过引用合并在此如同全部列出在此。其它一般性参考文献遍及本文。其中的程序被认为是本领域熟知的，仅为了便于读者阅读而提供。包含在其中的所有信息都通过引用合并在此。
实施例1
MSC迁移和靶向能力的表征(characterization)
人MSC购自(瑞士)，并利用吉姆萨染色和人间充质干细胞(hMSC)典型 的细胞表面标记的FACS分析进行表征。如图1A-1C所示，该细胞似乎对CD90、CD105、CD44和CD29呈阳性，而对CD133、CD31、CD34和CD144呈阴性，如对hMSC预期的一样。
还测试了hMSC朝向癌细胞迁移的能力。在这些实验中，用红色荧光染料(DiI)标记hMSC，同时用绿色荧光染料(DiO)标记数种其它细胞系(包括前列腺癌细胞系-PC3)。将标记的细胞逐滴接种于组织培养板中，温育72小时并利用Maestro体内显像仪(in vivoImager)显像(图2)。如所看到的，表明hMSC朝向PC3癌细胞特异性迁移，同时“避开”与其它细胞系(BHK、Cf2Th和COS-7)相互作用。
另外进行了验证调整hMSC对乳腺癌细胞系MCF7的靶向能力的实验。对此，人hMSC用或不用MCF7来源的调整培养基培养，用DiI(红色)标记，并与用DiO(绿色)标记的MCF7细胞一起共培养。温育2小时后，洗涤培养物，利用荧光显微镜图像分析测定每种细胞类型和细胞重叠(细胞覆层，cell overlay)(黄色)的覆盖范围。假设DiI与DiO的重叠是由于这两种细胞类型的物理相互作用引起的，那么重叠百分比可以代表这两种细胞类型的膜相互作用量。如图3所示，调整hMSC与MCF7细胞一起温育将导致总细胞覆盖范围中有7％重叠(覆层，overlay)，相比之下，在利用未调整hMSC时无重叠发生(p＜0.001)。这种明显的靶向性显然不同于图2中描述的迁移，因为它主要由hMSC与癌细胞之间的膜相互作用控制，而不依据很大程度上受可溶性因子介导的hMSC的迁移能力。
实施例2
从hMSC制备的细胞来源的脂质体表征
细胞来源的脂质体制备-收获约107个细胞，用PBS洗涤。然后通过将细胞在4℃下重悬于冰冷的pH 7.4Tris-镁(TM缓冲液，0.01M Tris，0.001M MgCl2)中15min，对该细胞进行低渗处理。低渗处理后，用定转子机械均质机(rotor-stator mechanical homogenizer)(Taquara，RJ，Brazil)以22,000rpm均质化细胞1min，使该细胞变成空胞(通过位相显微术证实95％的细胞膜破裂)。为了使空胞悬浮液稳定，立即在该悬浮液中加入60％(w/w)蔗糖溶液从而使终浓度为0.25M或按体积计为10％。然后4℃下以3000rpm离心空胞15min。弃去上清液，用含0.25M蔗糖的pH 7.4TM缓冲液洗涤空胞球粒两次，该洗涤通过重复执行悬浮和4℃下以3000rpm离心15min的操作完成。为了获得超声处理的空胞，将重悬的球粒用VibraCell VCX750(Sonics&Materials Inc.，Newtown，CT)以27％的振幅超声处理5秒，并在4℃下以3000rpm离心15min。超声处理的空胞球粒然后再次用含有0.25M蔗糖的pH8.6TM缓冲液洗涤两次，该洗涤通过重复执行悬浮和4℃下以3000rpm离心15min的操作完成。为了形成单层脂质体，手动使超声处理的空胞重悬球粒连续21次通过孔隙尺寸为0.4μm和0.1μm的聚碳酸酯膜(Osmonics Inc.，Minnesota USA)挤出。所挤出的脂质体然后在4℃下以150,000g离心45min。弃去上清液，用pH 8.6的TM缓冲液重悬所得脂质体球粒。
细胞来源的脂质体表面蛋白质PEG化(根据Croyle，M.A.等人，2004描述的方法)-收获约107个细胞，用PBS洗涤。然后通过将细胞在4℃下重悬于冰冷的pH 7.4Tris-镁(TM缓冲液，0.01M Tris，0.001M MgCl2)中15min，对该细胞进行低渗处理。低渗处理后，用定转子机械均质机(Taquara，RJ，Brazil)以22,000rpm均质化细胞1min，使该细胞变成空胞(通过位相显微术证实95％的细胞膜破裂)。为了使空胞悬浮液稳定，立即在该悬浮液中加入60％(w/w)蔗糖溶液从而使终浓度为0.25M或按体积计为10％。然后4℃下以3000rpm离心空胞15min。弃去上清液，用含0.25M蔗糖的pH 7.4TM缓冲液洗涤空胞球粒两次，该洗涤通过重复执行悬浮和4℃下以3000rpm离心15min的操作完成。为了获得超声处理的空胞，将重悬的球粒用VibraCell VCX750(Sonics&Materials Inc.，Newtown，CT)以27％的振幅超声处理5秒，并在4℃下以3000rpm离心15min。超声处理的空胞球粒然后再次用含有0.25M蔗糖的pH 8.6TM缓冲液洗涤两次，该洗涤通过重复执行悬浮和4℃下以3000rpm离心15min的操作完成。为了形成单层脂质体，手动使超声处理的空胞重悬球粒连续21次通过孔隙尺寸为0.4μm和0.1μm的聚碳酸酯膜(Osmonics Inc.，Minnesota USA)挤出。所挤出的脂质体然后在4℃下以150,000g离心45min。弃去上清液，用pH 8.6的TM缓冲液重悬所得脂质体球粒。
利用Bradford蛋白质分析法测定该脂质体表面上的蛋白质含量，以牛血清白蛋白(BSA)作为标准。琥珀酰亚胺基琥珀酸酯活化的单甲氧基-PEG得自Sigma Chemicals(St.Louis，Mo.)，将它以与前面利用Bradford分析法测得的脂质体蛋白质含量10∶1的比例加入到该重悬的脂质体中。例如，每1μg蛋白质加入10μg单甲氧基-PEG。在25℃通过轻轻地搅动进行单甲氧基-PEG与脂质体之间的结合反应。通过加入相对于所加入单甲氧基-PEG量的10X的L-赖氨酸(Sigma Chemicals)终止反应。在用pH 8.6的TM缓冲液平衡的Micro-BioSpin P-30色谱柱(Bio-Rad)上，通过更换缓冲液除去未反应的游离PEG、过量的赖氨酸和反应副产物。
CDL FACS分析.材料-耦合缓冲液-用于预先洗涤和使Dynabeads M-280结合到脂质体上。该缓冲液由0.1M pH 7.4的钠磷酸盐缓冲液，溶解在蒸馏水中并调节至1升的2.62gNaH2PO4x H2O(MW 137.99)和14.42g Na2HPO4x 2H2O(MW 177.99)组成。洗涤、封闭和储存缓冲液-含有0.1％(w/v)BSA的pH 7.4的PBS：在80ml 0.01M pH 7.4的钠磷酸盐中加入0.88gNaCl(MW 58.4)和0.1％(w/v)BSA。充分混合并用0.01M pH 7.4的钠磷酸盐(Na-phosphate)调节体积至100ml。
方法：按前面描述的方法从2x107个hMSC制得脂质体。使用甲苯磺酰基活化的顺磁M-280(invitrogen)，因为它们可以与任何蛋白质和/或与蛋白质结合的脂质体非特异性地共价结合，而且稍后可以通过流式细胞术进行分析。利用磁力分离设备(MACS，DynalTM Magnetic Particle Separator-Invitrogen)，用耦合缓冲液(couplingbuffer)洗涤该珠粒。为了增大它们与蛋白质结合的能力，然后进一步用添加到耦合缓冲液中的3M硫酸铵洗涤该珠粒。然后，准备4个含有107个珠粒的样品，分别为：仅珠粒、珠粒与脂质体、珠粒与第二抗体标记的脂质体(同种型对照)，以及与用第一抗体和第二抗体标记的脂质体结合的珠粒(测试样品)。在每个样品中添加约5x106个细胞等效脂质体。然后在4℃下温育脂质体和珠粒至少12小时。附连后，将样品重悬在洗涤\封闭缓冲液中。将每个样品悬浮在200μl总体积中。首先，将小鼠MAB抗人CD29、CD44、CD90或CD105以1∶100的比率加入到合适的样品中。RT下温育样品30min。接着，利用磁力设备洗涤样品两次。然后加入第二AB(FITC-结合的山羊抗小鼠抗体)并在RT下避光温育样品30min。所有抗体，第一抗体和第二抗体都购自BD-Becton，Dickinson and Company。如前所述洗涤样品后，对样品进行电泳(run)并利用FACSCalibur和CellQuest Pro(BD)进行分析。
结果
预期PEG化细胞来源的脂质体(PEG-CDL)将受到保护而免遭调理(opsonization)和降解，因而具有隐形特性(stealth property)和较长的体内循环时间。而且，PEG化可以降低脂质体与非靶细胞一样以非特异性方式结合和融合的风险17-19。
CDL的低温TEM显像表明，PEG化对CDL的理想小单层形态没有明显影响(图4A-4B)。然而，与在相同浓度和在相同条件下显像的未PEG化脂质体(图4B)相比，PEG化脂质体(图4A)的分散性似乎更大，而凝聚性似乎更小。明显地，PEG化不但不会损坏脂质体的形态，而且它还可以提高它们的分散性和稳定性。利用数量重量和体积重量DLS分析(DynamicLight Scattering，Malvern Nanosize)进一步分析CDL的尺寸和尺寸分布。虽然数量重量DLS分析(图5A)表明PEG化之后脂质体的尺寸增大(从～30nm增大至-100nm)，但体积重量DLS分析(图5B)表明PEG的加入对该系统有均质化作用，因而脂质体尺寸分布有着显著的降低。显然，PEG基团的加入稳定了该系统并阻止聚集，尽管Z电位从-17.9mV下降到-10.2mV(图5C)。
最后，通过FACS分析(图6)证实了MSC特异性表面标记在hMSC来源的脂质体上的表达。如所示的，该CDL保留了它们的细胞质膜对称性和正确定向(correctly oriented)的典型hMSC表面标记(即，CD44、CD29、CD90和CD105)的表达。
实施例3
CDL结合并特异性靶向癌细胞系
利用共聚焦显微镜成像和流式细胞术分析确定从hMSC制备的，荧光标记的CDL与前列腺癌细胞(PC3)的结合。如图7A所示，大多数囊泡有利于细胞结合。另外，该囊泡在细胞膜内被检测到，并与该细胞膜融合(图7A)。
流式细胞术分析表明，大多数细胞以浓度依赖方式(图8A)结合囊泡，因而使得脂质体结合程度可以根据细胞的平均荧光强度确定。
为了测试对癌细胞系的特异靶向性，从之前已与源自前列腺癌细胞系(PC3)，和源自非人细胞系(BHK)的调整培养基温育24小时的hMSC制备DiI标记的CDL。将所得的“调整”CDL，以及从未调整hMSC制备的CDL(对照)与PC3和BHK细胞温育15min、1小时和3小时。温育后，洗涤、收获并通过流式细胞术分析细胞(图9)。
给定特定调整培养基(无CM、BHK-来源和PC3-来源)和温育时间(15min、1小时和3小时)，根据下面公式计算每个实验的特异性指数：
特异性指数结果概括在下表3中，该结果不但表明该系统对癌细胞表现出特异性，而且这种特异性，与预期的一样，随着温育时间降低。另外，特异性指数值表明，该系统对癌细胞的特异亲和性很大程度上受到在CDL制备之前将细胞暴露于各种调整培养基中这一处理的影响。
表3-CDL与前列腺癌PC3细胞系结合的特异性指数
实施例4
在CDL内的蛋白质包埋
sTRAIL生产
培养基和缓冲液-从16gr BactoTM胰化蛋白胨(Tryptone)(BD货号：211705)、10grBactoTM酵母抽提物(DIFCO货号：212750)和5gr NaCl(化学纯)制备IL 2YT培养基。用于在Petri培养皿中进行培养的培养基含有位于上面组分之上的16gr Agar Granulated(DIFCO货号：214530)。对该培养基进行高压灭菌。用2gr KC1、2.4gr KH2PO4、14.4grNa2HPO4·7H2O和80gr NaCl制备PBSX10。用DDW将体积调节至1L，并通过0.2μm过滤器(滤膜，filter)对缓冲液过滤灭菌。
质粒、DNA、细菌和抗生素-pGEX-2TK质粒中的GST-sTRAIL编码DNA由Bethesda，MD的Stanley Lipkowitz博士友情提供，利用100μg/ml氨必西林(Ampicillin)作为选择剂将该质粒导入到大肠杆菌BL21中。从溶解在超纯DDW(UP-水)中至终浓度为100mg/ml的氨必西林钠盐(Sigma货号：A9518)制备氨必西林储液，并通过0.2μm过滤器过滤。
另外的材料：乙醇99％脱水(FRUTAROM货号：2355516400)；D(+)葡萄糖(Sigma货号：G5146)；IPTG(Ornat Biochemicals货号：INA-1758-1400)；Complete Mini无EDTA蛋白酶抑制剂鸡尾酒片(EDTA-free Protease inhibitor cocktail tablet)(Roche AppliedScience货号：04693159001)；DTT-DL-二硫苏糖醇溶液(Sigma货号：43816)；GSH珠(GEHealthcare)；谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B(10ml，Danyel Biotech货号：17-0756-01)；和L-还原型谷胱甘肽(Sigma货号：G4251)。
设备：Amicon Ultra-15离心过滤器(Millipore货号：UFC901024)和French Press细胞破碎系统。所有溶液都通过0.2μm过滤器过滤灭菌；第2天(步骤4，IPTG O/N诱导之后的细菌球粒)之前的所有操作程序都在Sterile Hood中进行。
Swith 1/100GST-TRAIL甘油储液(例如，在40ml培养基中的400μlGST-追踪(trail)甘油储液)。该溶液在37℃，250RPM下的振荡温育器(shaking incubator)中温育O/N。
第2天
步骤2：使“起子(starter)”培养物在1000g下减速旋转(spin down)15min从而除去该抗生素。弃去上清液，并重悬在40ml新鲜2YT中。在Sterile Hood中，将重悬的40ml步数(步骤号，step number)1中的O/N制品(preparation)添加到4L烧瓶中的2L2YT中(替换地在两支均含1L 2YT的2L烧瓶中加入20ml步数1中的O/N制品重悬球粒)。将该溶液在37℃，250RPM下的振荡温育器中温育2-3小时。应采取措施确保温育时间不超过3小时，直至O.D.值到达2.5-3.0(建议在2小时后测量O.D.595)。
步骤3：就在IPTG诱导之前，添加PBS至终浓度为0.1X从而维持培养物的pH。添 加EtOH(99％脱水)至终浓度为2％(在2L培养物中添加的EtOH为40ml)，从而增加蛋白质的溶解度。按10ml/L添加作为碳源的0.5M葡萄糖至终浓度为5mM。
步骤4：在该补加的培养物中加入500μM IPTG。于20-25℃在振荡温育器(250RPM)中温育培养物过夜。
第3天
步骤5：以6,000g使细菌形成球粒，持续10min，弃去上清液。利用按1片/10ml PBS补加4个蛋白酶抑制剂片(Roche Applied Science)的40mlPBS，将所有细菌重悬在50mlFalcon管中。
步骤6：让来自步数5的细菌两次通过French Press细胞破碎系统，如此使细胞裂解。替换地，取10ml等分试样于50ml管中，在冰上以30％的力(功率，power)超声破碎4次，每次10秒。细胞破碎后，在每40ml细胞裂解液中加入以下物质：0.1％Triton-X(40μlTritonX100)、1mMMgCl2(40μl的1M MgCl2储液)和1mM DTT(40μl的1M DTT储液)。充分混合该溶液并于RT在摇摆器或振荡器中温育15min。
步骤7：使细菌裂解液在4℃，16,900g下减速旋转10min。吸出上清液，收集在50ml管中。
步骤8：与GSH(谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B珠)的结合-取3ml GSH珠于15ml Falcon管中，用PBS洗涤三次。收集上清液，并再次离心，因为有大量珠散落。将洗涤的珠加入到来自步数7的细菌细胞裂解液中，并在4℃翻滚温育1小时。
步骤9：使来自步数8的，含有琼脂糖凝胶珠的细菌细胞裂解液在2000RPM下的MULTI CENTRIFUGE CM 6M ELMI中减速旋转1min，从而使蛋白质结合的珠与细胞裂解液分离。收集上清液，再次离心从而使上清液中剩余的琼脂糖凝胶珠(这些琼脂糖凝胶珠在第一次离心中可能没有形成球粒)形成球粒(沉淀，pellet)。将两次离心获得的，含有sTRAIL-结合珠的球粒用5ml PBS洗涤5次，每20ml PBS中补加了0.1％Triton-X100、150mM NaCl和1个蛋白酶抑制剂片。
步骤10：GST-sTRAIL的洗脱-如前所述的使该珠粒减速旋转，吸出上清液。加入3ml50mM在10mM Tris-HCl和100mM NaCl中的谷胱甘肽(pH 8.5)。使每3ml涡旋2min，并将蛋白质洗脱到上清液中。如前所述的吸出上清液，保存上清液。重复执行洗脱操作程序3-4次。
步骤11：利用Amicon Ultra-1510K NMWLnumber UFC9010浓缩蛋白质，所得蛋白质的产量为约5mg/L培养物。制得终浓度为0.2mg/ml的sTRAIL。
sTRAIL包埋-收获约107个细胞，用PBS洗涤。然后通过将细胞在4℃下重悬于冰冷的pH 7.4Tris-镁(TM缓冲液，0.01M Tris，0.001M MgCl2)中15min，对该细胞进行低渗处理。低渗处理后，用定转子机械均质机(Taquara，RJ，Brazil)以22,000rpm均质化细胞1min，使该细胞变成空胞(通过位相显微术证实95％的细胞膜破裂)。为了使空胞悬浮液稳定，立即在该悬浮液中加入60％(w/w)蔗糖溶液从而使终浓度为0.25M或按体积计为10％。然后4℃下以3000rpm离心空胞15min。弃去上清液，然后用含0.25M蔗糖的pH 7.4TM缓冲液洗涤空胞球粒两次，该洗涤通过重复执行悬浮和4℃下以3000rpm离心15min的操作完成。为了获得超声处理的空胞，将重悬球粒用VibraCell VCX750(Sonics&Materials Inc.，Newtown，CT)以27％的振幅(amplitude)超声处理5秒，并在4℃下以3000rpm离心15min。超声处理的空胞球粒然后再次用含有0.25M蔗糖的pH 8.6TM缓冲液洗涤两次，该洗涤通过重复执行悬浮和4℃下以3000rpm离心15min的操作完成。此后，将sTRAIL加入到悬浮的超声处理空胞(在pH 8.6的缓冲液中)中至终浓度为1μg/1ml空胞悬浮液。为了形成含sTRAIL的单层脂质体，手动使含sTRAIL的超声处理空胞重悬球粒连续21次通过孔隙尺寸为0.4μm和0.1μm的聚碳酸酯膜(Osmonics Inc.，Minnesota USA)挤出。所挤出的含sTRAIL脂质体然后在4℃下以150,000g离心45min。弃去含有多余未包封的sTRAIL的上清液，用pH 8.6的TM缓冲液重悬所得脂质体球粒。
结果
TRAIL-肿瘤坏死因子相关的细胞凋亡诱导剂是II型跨膜蛋白，其可以诱导不同起源的肿瘤细胞凋亡，同时不伤害大多数正常细胞20-24。已证明，递送全长和截断的分泌形式的TRAIL(sTRAIL)都可以诱导培养物中和体内的多种癌细胞凋亡25，26。我们利用sTRAIL进行的初步实验包括，制造sTRAIL和使它以1μg/ml的终浓度被动包封在hMSC CDL内。所得含sTRAIL的CDL的低温TEM显像(图10A，左侧)表明，与在相同条件下制备和显像的空CDL(图10B，左侧)相比，含sTRAIL的CDL内累积有14-20nm蛋白胶粒。在通过数字重新着色使该图像从灰度变成黑白(图10A和10B，右侧)之后，sTRAIL胶粒甚至更清晰可见。
实施例5
通过与其它脂质体融合制备“混合(杂合，hybrid)CDL”
通过使CDL与其它脂质体(合成或细胞来源的)融合，可以将各种分子(例如，蛋白质、脂质、添加剂和甚至包封物(encapsulates))导入、结合或附连到CDL表面上，从而产生“混合CDL”。例如，由合成的良好界定的脂质制成的脂质体制剂可以在它的表面上与蛋白质结合，或者可以包含期望的包封物。然后，依靠诱导的所述合成脂质体和CDL之间的膜融合，可以形成混合CDL。这些混合CDL包含它们来源于其中的细胞膜的脂质和蛋白质，以及起初在所融合的合成脂质体上调配的脂质和蛋白质。此类在混合CDL上导入“非自然”材料的方法可以用来附连或结合与一些特性相关的任何分子或部分，所述特性不限于脂质体靶向性、治疗效果、诊断效果、致使隐形的特性等。还可以利用此种融合，通过导入合成脂质、添加剂(例如，胆固醇、神经酰胺)等来改变CDL的生物化学或化学物理特性。还可以利用此种融合增大所述CDL的包封率。既然CDL的包封主要受限于被动包封，那么与主动加载高浓度包封物的合成脂质体融合就可以显著提高CDL的包封率。
制备合成脂质体的方法在本领域中是熟知的，主要包括使脱水脂质水合(hydration)从而形成层状结构，随后均质化这些层状结构从而形成脂质体。具有所述应用的合成脂质体可以通过本领域中已知的任何方法制造，包括但不局限于，溶剂蒸发法、溶剂更换法、清洁剂透析法、挤出法、超声处理法、冷冻干燥法、逆相蒸发法、乙醇/醚注入法、搅动和/或任何其它形式的机械均质法。脂质体可以由多种合成和天然来源的脂质制备，并可以包含或者不包含另外的添加剂(例如，胆固醇、神经酰胺等)。使物质主动包封在此种合成脂质体中的方法主要基于膜pH梯度或主动转运体，此类方法在本领域中也是熟知的，可以用来制取具有高包封率的合成脂质体。
使CDL和其它脂质体融合形成“混合CDL”，这可以容易和轻松地通过在脂质体中加入短链游离PEG(-200-500Da)完成。PEG诱导的囊泡融合机制被认为与随后将导致囊泡凝聚和融合的水分活度(water activity)降低和脂质头基脱水有关。也可以在称为电融 合的工艺中通过电穿孔人工诱导融合。据认为，这种现象由电穿孔期间形成的积极主动边(energetically active edges)引起，这种积极主动边可以用作使两个双层之间的茎生长成核的局部缺陷点。也可以通过在脂质体混合物(例如，Cymal-5TM、1-S-辛基β-D-硫代吡喃葡萄糖苷等)中加入清洁剂(通常低于2％)，在轻微搅动下温育并随后进行清洁剂透析，完成融合。
实施例6
hMSC空胞和hMSC来源的CDL的蛋白质组学分析
方法
对含有源自hMSC的空胞细胞和CDL的4个样品进行蛋白质组学分析，所述hMSC受到或未受到源自前列腺癌细胞系(PC3)的培养基的调整。为了制取调整空胞和CDL，在收获之前将hMSC在由50％的源自PC3细胞的调整培养基组成的培养基中温育24小时。然后收获细胞，并通过前面描述的方法制备超声处理的空胞和CDL。将经超声处理的，来自调整和未调整hMSC(106个细胞)的空胞重悬在1ml pH 7.4的TM缓冲液中用于分析。将源自7x106个调整和未调整hMSC的细胞来源的脂质体重悬在50μl pH 8.6的TM缓冲液中。
将样品送往TECHNION蛋白质组学中心-以色列科技协会(Israel Institute ofTechnology)进行蛋白质组学分析。简言之，用胰蛋白酶消化样品，通过LC-MS/MS分析所得的肽。通过HPLC分离肽混合物，将其电喷射到离子阱质谱仪(ion-trap massspectrometer)(OrbitrapTM)上。进行质谱实验是为了分析肽质量电荷比光谱和测定蛋白质质量。为了进行另外的分析和鉴定，通过碰撞诱导分解(CID)将肽进一步片段化，并再次分析。利用Sequest 3.31软件，根据uniprot数据库的人部分，鉴定该肽。所有蛋白质结果都以Uniport登录号给出。为每种蛋白质/登录号测定下列值。
MW-分子量
Ppro-找到与偶然观察到的匹配一样或者优于它的匹配的概率。为该蛋白质展示的值是最佳肽匹配(得分最低的肽)的概率。
Pep计数-所鉴定肽的总数目。
平均值-对每种蛋白质鉴定的前3种肽(top 3 identified peptides)峰面积的平均值。
平均SE-平均标准误差。
Med-对每种蛋白质鉴定的所有肽峰面积的中位数(median)。
MedErr-中位数绝对偏差(median absolute deviation)。
蛋白质名称。
结果
从这4个样品中的一个或多个中鉴定出数百种蛋白质，这些蛋白质可以分为以下4个不同的组：
1.普遍存在于所有这4个样品，即调整和未调整空胞及CDL中的蛋白质(表7)，
2.普遍存在于空胞或调整空胞中，但不存在于CDL中的蛋白质(表5)。这些蛋白质很可能或大多数是没有完全从空胞中除去的细胞质物质残余物。
3.仅在调整空胞和CDL中普遍存在的蛋白质(表6)。这些蛋白质很可能或大多数是仅在诱导或暴露于调整培养基中之后才被表达的膜蛋白质。
4.在除从未调整hMSC制得的CDL之外的所有样品中都普遍存在的蛋白质(表7)。这些蛋白质很可能或大多数是在未调整hMSC上低水平表达而在来源于它们的CDL上完全耗尽的膜蛋白质。用调整培养基诱导hMSC很可能将这些蛋白质水平升高至使它们在调整CDL上变得更明显的程度。
表4-普遍存存于调整和未调整的空胞和CDL中的蛋白质
表5-普遍存在于空胞或调整空胞中但不存在于CDL中的蛋白质
表6-仅在调整空胞和CDL中普遍存在的蛋白质
表7-存空胞、调整空胞和调整CDL中普遍存存，但不存存于未调整CDL中的蛋白质。
虽然本发明已结合其具体实施方式进行描述，但显然，对于本领域技术人员而言，许多替换、修改和变更都是很明显的。因此，本发明旨在包括落在附属权利要求的精神和宽范围内的所有此类替换、修改和变更。
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都通过引用完整地合并在本说明书中，如同每篇单独的出版物、专利或专利申请单独地明确被指出通过引用合并在此。另外，本申请中任何参考文献的引用或列出不应该被解释为承认此类参考文献是本发明的现有技术。对于使用的章节标题，它们不应该被解释为限制性的。
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Claims (16)

1.一种包含附连到药剂上或包封药剂的脂质体的物质组合物，所述脂质体由间充质干细胞的全细胞膜组分组成并且具有自然膜对称性。
2.根据权利要求1所述的物质组合物，其中，所述间充质细胞是人细胞。
3.一种包含由人间充质干细胞的全细胞膜组分组成的脂质体的物质组合物，其中所述脂质体具有自然膜对称性。
4.根据权利要求1-3所述的物质组合物，其中，所述细胞膜经受基因修饰从而表达外源蛋白。
5.根据权利要求3-4所述的物质组合物，其中，所述脂质体包封药剂，或者附连到药剂上。
6.根据权利要求3-4所述的物质组合物，其在人对象中是非免疫原性的。
7.根据权利要求1-6所述的物质组合物，其中，所述全细胞膜组分的细胞来源包含宿主对象的自体细胞。
8.根据权利要求1-6所述的物质组合物，其中，所述全细胞膜组分的细胞来源包含宿主对象的非自体细胞。
9.根据权利要求1所述的物质组合物，其中，所述药剂是诊断剂。
10.根据权利要求1-9所述的物质组合物，其中，所述脂质体在其外表面上附连到合成的聚合物上。
11. 根据权利要求1-10所述的物质组合物，其中，所述脂质体的尺寸在30-1000 nm的范围内。
12.根据权利要求1-11所述的物质组合物，其中，所述脂质体进一步由合成的脂质组成。
13. 一种生产具有自然膜对称性的脂质体的方法，所述方法包括：
（a）使人间充质干细胞经受低渗条件，以便获得破裂的细胞膜和/或空胞；和
（b）使所述破裂的细胞膜和/或空胞均质化从而产生具有自然膜对称性的脂质体，其中，所述均质化通过以下实现：
（c）超声处理所述破裂的细胞膜和/或空胞，和/或
（d）通过具有预定孔隙的基质挤出所述破裂的细胞膜和/或空胞。
14.根据权利要求13所述的方法，进一步包括在步骤（c）之后使合成的聚合物结合到所述脂质体上。
15.一种将药剂包封在脂质体中的方法，所述方法包括根据权利要求13所述的方法制造脂质体，和在所述均质化步骤之前加入所述药剂。
16.一种包含作为活性成分的权利要求1所述的物质组合物、和药物可接受载体的药物组合物。
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